Mobili versija | Apie | Visos naujienos | RSS | Kontaktai | Paslaugos
 
Jūs esate čia: Pradžia » Visos temos » Mokslas » Žmogus ir medicina

„Genų žirklės“ COVID-19 diagnostikoje: naujosios kartos testai rezultatą pateiks per pusvalandį

2021-05-18 (0) Rekomenduoja   (6) Perskaitymai (165)
    Share

Koronavirusui agresyviai plintant visame pasaulyje, imta kalbėti, kad turimos kontrolės priemonės nepakankamai efektyvios. SARS-CoV-2 infekcijai nustatyti naudojamų polimerazinės grandininės reakcijos (PGR) testų rezultatų reikia ilgai laukti, be to, testai kartais klysta. Personalui imti mėginius iš potencialiai infekuotų asmenų nosiaryklės – sudėtinga ir pavojinga. Vėlesniais ligos etapais virusas viršutiniuose kvėpavimo takuose sunkiai randamas.

Todėl pasaulis suskubo ieškoti alternatyvių technologijų greitiesiems PGR testams patobulinti. Viena tokių technologijų yra „genų žirklių“ – CRISPR endonukleazių – pritaikymas. Pasitelkę šią ir kitas inovatyvias technologijas, COVID-19 testus, tinkamus seilių ėminiui tirti, kuria ir Lietuvos mokslininkai, dirbantys Vilniaus universiteto Gyvybės mokslų centre ir kitose šalies mokslo įstaigose.

Dabartiniai testai - netobuli

Šiuo metu COVID-19 ligos tiksliniam ir profilaktiniam testavimui naudojamas auksiniu standartu tapęs kiekybinis atvirkštinės transkripcijos PGR (AT-PGR) testas, tiriamame mėginyje aptinkantis bent dvi SARS-CoV-2 viruso sekas. Laboratoriniu AT-PGR testu vieno tyrimo metu aptinkama viruso seka ir įvertinama ėminio paėmimo kokybė. Naudojant in vitro diagnostikos (IVD) rinkinius, metodo diagnostinis jautrumas ir specifiškumas yra labai aukštas ir atitinkamai siekia 95 ir 99 proc.

Analitinis jautrumas taip pat aukštas – tyrimui pakankamas specifinio ėminio kiekis nuo 5 iki 100 viruso kopijų mikrolitre. Skubią pagalbą teikiančios ligoninės neišsiverčia be greitųjų AT-PGR testų. Šiam tyrimui reikia 10–100 kartų didesnio viruso RNR kiekio, bet metodo jautrumas ir specifiškumas pakankamai didelis. Metodas veikia uždaroje sistemoje, reikalauja tam skirtos įrangos, tad ne visada prieinamas.

Antigenų testais tiriama ne genetinė viruso medžiaga, o viruso baltymai, kurių prieš detekciją neįmanoma pagausinti. Dėl to skiriasi ir metodo analitinis jautrumas – antigenų testui reikia tūkstantį kartų didesnio virusų kiekio ėminyje. Šis testas efektyvus tik tiriant atvejus aktyvioje infekcijos fazėje ir be rezultato patvirtinimo AT-PGR metodu COVID-19 diagnostikai nėra tinkamas. Dėl to nerekomenduojama šių testų naudoti kaip pagrindinio testavimo metodo, jie yra labiau skirti masiniam testavimui didelės rizikos zonose (pvz., oro uostuose).

 

Antikūnų testai naudojami siekiant aptikti prieš ligos sukėlėjus organizme susidariusius specifinius baltymus – IgM ir IgA klasių antikūnai rodo aktyvią infekciją, o IgG – susiformavusį ilgalaikį imuninį atsaką. Deja, antikūnų testai yra gerokai vėluojantys ir jų informatyvumas mažas. Priešvirusinių antikūnų tyrimas leidžia aptikti apatinių kvėpavimo takų SARS-CoV-2 infekciją, kuri būdinga vėlesnėms ligos stadijoms, kai nosiaryklės mėginys nebėra informatyvus, bet geriausiai testas tinka persirgimui patvirtinti po besimptomės ligos.

Naujosios kartos testai ypač greiti

Testų įvairovė neišsprendžia pagrindinio pandeminės situacijos uždavinio – greitai ir patikimai identifikuoti infekcijos atvejus, kad liga neplistų, o sergantieji gautų reikiamą gydymą. Akivaizdu, kad pandemijos metu reikalingas greitas technologinis proveržis COVID-19 ligos diagnostikoje.

Mokslinėse laboratorijose jau kuriami naujosios kartos testai, skirti naudoti namuose, ligoninėse ar slaugos namuose. Mėginiui surinkti ar rezultatui įvertinti nereikia papildomo personalo. Diagnostikos prietaisai telpa kišenėje, tereikia mažo tiriamojo ėminio kiekio, naudojama nedaug reagentų ir rezultatas matomas per pusvalandį ar greičiau tiesiog prietaiso ekrane ar mobiliajame telefone. Neretai tokie testai virusui aptikti naudoja lengvai prieinamus organizmo skysčius ar kitus ėminius – seiles, kraują, šlapimą, burnos epitelio nuograndas.

„Genų žirklės“ COVID-19 diagnostikoje

Pasaulyje, taip pat ir Lietuvoje plėtojamos alternatyvios technologijos greitiesiems PGR testams kurti. Viena iš tokių technologijų yra „genų žirklių“ – CRISPR endonukleazių – pritaikymas. Originaliai CRISPR-Cas sistema yra bakterijų molekulinis mechanizmas, skirtas apsisaugoti nuo virusų. Sistema ne tik sunaikina virusines nukleorūgštis, bet ir kuria įgytą imunitetą, tad bakterija antrą kartą to paties viruso infekuota nebebus.

 

CRISPR sekos atsitiktinai nustatytos jau prieš daugiau kaip tris dešimtmečius, bet sistema plačiau tyrinėti pradėta tik pastaraisiais metais, pritaikius ją ligoms gydyti genų redagavimo būdu. Per pastaruosius penkerius metus atliktas ŽIV blokavimas pelėse ir išveiklintas moskitų „gebėjimas“ pernešti maliariją, tyrinėjamas raumenų distrofijos, cistinės fibrozės, Hantingtono, vėžinių ir daugybės kitų ligų gydymas. Šiais metais susidomėjimas CRISPR-Cas pasiekė aukščiausią tašką – sistema pirmąkart panaudota genomui redaguoti tiesiai žmogaus organizme, o už platų ir reikšmingą taikymą apvainikuota Nobelio premija.

CRISRR-Cas sistema veikia endonukleazės atrankumo principu – fermento aktyvumas priklauso nuo komplekse esančios sekos, kuri yra komplementari ieškomam fragmentui. Esant atitikimui, sukeliamas specifinis reporterinės sekos kirpimas, taip atpalaiduojant molekulę, lemiančią spalvinę ar kokią kitokią teigiamą rezultatą rodančią reakciją. Nieko nuostabaus, kad ši technologija imta taikyti ir COVID-19 nustatymui:

Sukurta prototipų greitajai COVID-19 detekcijai

CRISPR-Cas9 yra seniausiai naudojama sistema, kuri perkerpa savo taikinį. Tiriant COVID-19, teigiamo rezultato atveju vyktų specifinis kirpimas ir rezultatas būtų matomas 2 juostelių pavidalu. Tačiau šis metodas nėra optimalus, nes reikalinga specifinė įranga viruso RNR pagausinti ir rezultatui vaizdinti.

Cas13 baltymas atpažįsta RNR, taigi SARS-CoV-2 detekcijai gali būti naudojamas tiesiogiai, tačiau viruso RNR kiekis, jei nebus pagausintas COVID-19 testavimui, gali būti nepakankamas. Siekiant padidinti testo jautrumą, viruso RNR būtų verčiama į DNR ir gausinama pritaikius alternatyvius PGR metodus, kurie nereikalauja specifinės įrangos ir tausoja laiką (LAMP, RPA ir kt.), o rezultatas būtų matomas naudojant į lakmuso popierėlį panašias detekcijos sistemas. Šios technologijos buvo pradėtos plėtoti dar prieš COVID-19 pandemiją jautriam ir greitam kitų virusinių infekcijų nustatymui. Jau sukurta keletas CRISPR technologija paremtų prototipų greitajai COVID-19 detekcijai – „HUDSON“, „SHERLOCK“, „STOP“, „DETECTR“, „iSCAN“ ir kt. Šiuo metu tokie testai gali analizuoti po vieną mėginį ir užtrunka iki pusvalandžio, o testų diagnostinis jautrumas ir specifiškumas aukštas.

Naujosios kartos sekoskaita – nepakeičiama

 

Sekoskaita – išsamus genų sekos nustatymas – šiuo metu plačiai taikoma ligų diagnostikai. Dabar labai paplitusi naujosios kartos sekoskaita (NKS), kuri leidžia atlikti ir viso genomo analizę. Skirtingai nuo PGR ar CRISPR pagrindu veikiančių testų, sekoskaita leidžia iškart aptikti naują viruso atmainą. Į taikinį nukreipti diagnostiniai testai, deja, pakitus taikinio sekai gali pateikti klaidingą neigiamą atsakymą ir leisti naujai viruso atmainai išplisti populiacijoje. Virusai yra viena iš greičiausiai mutuojančių gyvybės formų pasaulyje, tad, siekiant stebėti viruso evoliuciją ir atrinkti specifiškas sekas tiksliems diagnostiniams metodams, sekoskaitos technologija išlieka nepamainoma.

Pasitelkus NKS, plačiai tiriama SARS-CoV-2 sukelta zoonozė, evoliucija, virulentiškumas. Didesnio masto NKS įtraukia ir žmogaus imuninių ląstelių sekoskaitą, kuri gali būti atliekama ir pavienėse ląstelėse. Toks tyrimas gali padėti išaiškinti imuninio atsako mechanizmus, rasti informatyviausius biožymenis diagnostikai ir taikinius gydymui. Pavyzdžiui, sirgdami COVID-19 ligoniai kenčia nuo bendro baltųjų kraujo kūnelių kiekio sumažėjimo. NKS duomenys rodo, kad ligai vystantis įjungiamas p53 baltymo atsako kelias ir aktyvuojama programuota limfocitų mirtis (apoptozė), kas paaiškina ligoniams būdingą ląstelių trūkumą.

Kompleksiški tyrimai – vertingai informacijai gauti

 

Viruso antigenų testai yra pigūs ir greiti, nes viruso baltymai, kaip ir RNR, aptinkami ankstyvose infekcijos fazėse. Baltymai paprasčiausiai nustatomi tuose skysčių biopsijos mėginiuose, kuriuose virusas išlieka gyvas – tai nosiaryklės arba ryklės tepinėliai, seilės. Šiuo metu antigenų testai pateikiami nedidelėse nėštumo testo tipo talpose. Antigenų, kaip ir antikūnų, testų jautrumas kelis kartus atsilieka nuo PGR testų, nes tiriami nepagausinami baltymai. Mažesnis ir specifiškumas, nes jie linkę pateikti neteisingą teigiamą rezultatą. Atsirandanti galimybė testus kombinuoti – iš vieno mėginio nustatyti ir virusinę RNR, ir viruso baltymus – labai padidintų testų jautrumą ir specifiškumą, sumažintų klaidingų teigiamų ir klaidingų neigiamų rezultatų, padėtų tiksliau identifikuoti atvejus be simptomų.

Antikūnų testai paprastai atliekami paėmus kraują, tačiau gali būti naudojami ir kiti organizmo skysčiai, pvz., seilės. Toks testas beveik nenusileidžia įprastiems serologiniams tyrimams, yra neinvazinis, mėginiui paimti nereikalingas specializuotas personalas. Tačiau imuninė sistema siekia kur kas plačiau ir giliau nei priešvirusiniai antikūnai, pavyzdžiui, koronavirusinei infekcijai būdingas savitas sekrecinis imuninis atsakas. Nustatyta, kad trečią COVID-19 ligos stadiją, hiperuždegimą, lemia Th-17 ląstelių sukeliama „citokinų audra“ (IL-6, IL-1β, IL-10, TNF ir kt.). Kartu su RNR tyrimu atliekant ir imuninio atsako komponentų testą, būtų galima patikslinti diagnozę ir prognozuoti ligos eigą – nustačius didesnius kiekius Th-17 ląstelių sekretuojamų citokinų, ligonis būtų hospitalizuojamas ir taip užkertamas kelias letaliai ligos eigai. Kompleksiškai atliekant viruso antigenų, antikūnų ir specifinių imuninės sistemos komponentų tyrimą, būtų galima gauti daug vertingos informacijos ne tik apie infekciją, bet ir apie organizmo atsaką į ją.

Kaukė, pranešanti, kad susirgote

 

Kaip jums patiktų apsauginė kaukė, pranešanti, kad jūs sergate, anksčiau, negu prastai pasijuntate? Ir tai nėra fantazija, o elektrocheminė sistema popieriuje, jaučianti vandenilio peroksidą iškvepiamame ore. Norint aptikti COVID-19, ant kaukės būtų galima imobilizuoti antikūnus ir spalviniai signalai išduotų apie infekciją anksčiau, nei pats susivoksite.

O štai viena iš šių metų Nobelio chemijos premijos laureačių Jennifer Anne Doudna kartu su kolegomis kuria minėta CRISPR technologija paremtą koronaviruso testą, kurio rezultatai bus nuskaitomi mobiliuoju telefonu. Modernių telefonų kamerų optika pajėgi aptikti testo generuojamą fluorescenciją ir pateikti rezultatą telefono ekrane. Testas neturi RNR pagausinimo etapo, viruso aptikimo riba – 100 viruso genomų mikrolitre, o greitis – 30 minučių.

Naujausiems COVID-19 nustatymo būdams galima pritaikyti posakį „Tobulumas slypi paprastume“. Net trims ketvirtadaliams COVID-19 sergančių asmenų būdingas dalinis ar visiškas uoslės netekimas, taigi kitų simptomų nejaučiantys žmonės gali atlikti „u-Smell-it“ kompanijos uoslės testą ir pasitikrinti. Be to, atskirti COVID-19 sergantį asmenį specialiai dresuojami šunys – toks testavimo būdas jau taikomas Helsinkio oro uoste.

Sakoma, kad gyvenime viskas eina ratu. CRISPR sistema, per evoliucijos tūkstantmečius susikūrusi bakterijų kovai su virusais, dėl mokslo pasiekimų gali būti naudojama COVID-19 infekcijos kontrolei. Kas žino, gal suvieniję jėgas pasaulio mokslininkai netolimoje ateityje CRISPR technologiją pritaikys tam, kad būtų greitai kuriamas įgytas imunitetas ir efektyviai gydoma COVID-19 liga.

Prof. dr. Sonata Jarmalaitė, dr. Kristina Šnipaitienė

Verta skaityti! Verta skaityti!
(6)
Neverta skaityti!
(0)
Reitingas
(6)
Komentarai (0)
Komentuoti gali tik registruoti vartotojai
Komentarų kol kas nėra. Pasidalinkite savo nuomone!
Kiti tekstai, kuriuos parašė Sonata Jarmalaitė Kristina Šnipaitienė
Naujausi įrašai

Įdomiausi

Paros
31(1)
29(0)
27(0)
25(6)
22(2)
22(0)
21(0)
19(1)
18(0)
Savaitės
90(1)
80(0)
77(6)
Mėnesio
111(22)
102(1)
92(0)
82(5)